來自RSR FIRS 實(shí)驗(yàn)室的 Sanders等發(fā)現(xiàn)[5]，小鼠促甲狀腺激素單克隆抗體與促甲狀腺激素受體(TSHR）的結(jié)合，可以被促甲狀腺激素受體自身抗體(TRAb)所抑制。實(shí)驗(yàn)室用放射性125I標(biāo)記的人TSHR單克隆抗體(M22™)構(gòu)建了一種分析方法[6]。
本文我們描述了一種檢測(cè)TRAb的新方法，其中TRAb競(jìng)爭(zhēng)抑制了促甲狀腺激素受體人單克隆抗體M22(生物素標(biāo)記)與包被于酶聯(lián)免疫法(ELISA)微孔板上的TSHR的結(jié)合。同時(shí)我們將基于M22與基于TSH結(jié)合抑制的方法進(jìn)行了比較。
研究對(duì)象與方法
檢測(cè)方法
三代TRAb（RSR促甲狀腺激素受體抗體檢測(cè)試劑盒）：基于M22與血清中TRAb競(jìng)爭(zhēng)抑制的ELISA法。TRAb每次檢測(cè)均包括一套使用正?；旌涎?HBD pool)稀釋后的TSHR自身抗體國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)NIBSC90/672。結(jié)果以每升M22-生物素結(jié)合的百分比抑制率為單位(1-[檢測(cè)血清的OD450/HBD的OD450])×100。
二代TRAb（RSR促甲狀腺激素受體抗體檢測(cè)試劑盒）：基于TSH與血清中TRAb競(jìng)爭(zhēng)抑制的ELISA法。
放免法：Southgate等人[7]所述，利用TRAb與125I標(biāo)記的TSH間競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合可溶性豬TSHR的機(jī)制測(cè)定血清中TRAb含量(RSR試劑盒)。
甲狀腺過氧化物酶(TPOAb)和甲狀腺球蛋白(TgAb)的自身抗體采用Beever等人[8]的直接測(cè)定法測(cè)定。TPOAb單位U/mL(NIBSC 66/387)，測(cè)量范圍為1.5 - 500 U/mL；TgAb單位U/mL(NIBSC 65/093)，測(cè)量范圍為3 - 1000 U/mL。
結(jié)果
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)90/672在三種不同的TSHR自身抗體檢測(cè)法中的劑量-效應(yīng)關(guān)系見圖1。
圖1 90/672對(duì)促甲狀腺激素受體(TSHR)與抗體結(jié)合抑制的影響。
標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)90/672 濃度為0.2 U/L時(shí)，對(duì)M22-生物素結(jié)合的抑制率約為10%；濃度為0.8 U/L時(shí)，對(duì)TSH-生物素結(jié)合的抑制率約為10%。在基于PEG的實(shí)驗(yàn)中，125I標(biāo)記的TSH結(jié)合抑制率約為10%時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度約為2 U/L。
在相同結(jié)合抑制率（10%）的前提下，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度由小到大依次為：M22-biotin，TSH-biotin，125I-TSH(PEG)。
三代TRAb的批內(nèi)檢測(cè)精密度：
對(duì)一份正?；旌涎暹M(jìn)行64次測(cè)量得到的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為0.041±0.04 U/L (450 nm處的平均吸光度=2.1±0.079)，表明該檢測(cè)法的檢測(cè)下限（2倍SD）為0.12 U/L。
三代TRAb的批間精密度如下（圖2）：在0.3 U/L時(shí)為14%，在6 U/L時(shí)為6.5%。
二代TRAb的批間CV值，在1 U/L時(shí)為20%，在4 U/L時(shí)為6%。
圖2 不同患者血清間變異系數(shù)(CV)與TRAb濃度的關(guān)系圖。
三代TRAb測(cè)定M22結(jié)合的抑制率如下：
圖3 基于M22-生物素對(duì)TSHR結(jié)合的抑制，使用ELISA檢測(cè)不同患者組的自身抗體。MG，重癥肌無力；SLE，全身性紅斑狼瘡；RA，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；HBD，健康獻(xiàn)血者。
在108例Graves組中三代TRAb與二代TRAb之間結(jié)合抑制率的相關(guān)系數(shù)r值為0.99，如圖4所示。
圖4 比較M22-生物素對(duì)TSHR包被的ELISA板孔和TSH-生物素對(duì)TSHR包被的ELISA板孔的抑制作用，來自108名Graves病患者(治療和未治療)。如圖所示的線與每個(gè)軸呈45度角。通過圖上的點(diǎn)進(jìn)行最佳擬合的直線(未顯示)的方程是y=1.084x-10.56，r=0.99。
三代TRAb、二代TRAb和125I-TSH（放免法）檢測(cè)TRAb的受試者工作曲線(ROC)[9]見圖5。在此分析中，靈敏度數(shù)據(jù)來自108例Graves病組。特異性數(shù)據(jù)來自60例無臨床甲狀腺疾病證據(jù)的患者(和臨床工作人員)組。當(dāng)特異性為100%時(shí)，三代TRAb、二代TRAb和放免法的靈敏度分別為95%、89%和62%。
圖5 三種不同TSHR自身抗體檢測(cè)的靈敏度與100-特異性的關(guān)系圖。
干擾性研究中，TSH (NIBSC 94/674)最高達(dá)3 U/L，人絨毛膜促性腺激素(hCG) (NIBSC 75/589)最高達(dá)160 U/mL，促卵泡激素FSH (NIBSC 92/640)最高達(dá)69 U/mL，促黃體生成素LH (NIBSC 80/552)最高達(dá)10 U/mL，對(duì)M22-生物素與TSHR的結(jié)合沒有影響(結(jié)合的最大抑制率為0%)。
討論
我們的結(jié)果表明，三代TRAb與二代TRAb及其類似方法相比，可以檢測(cè)出更低濃度的TRAb標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(NIBSC 90/672)。 三代TRAb的精密度優(yōu)于二代TRAb產(chǎn)品。
在108例Graves病組，幾乎所有的樣本用三代TRAb比二代TRAb有更好的競(jìng)爭(zhēng)抑制效果。以二代檢測(cè)抑制率為20%為對(duì)照，只有1份血清樣本在基于M22檢測(cè)的三代檢測(cè)中具有明顯較弱的效果(14%抑制率)(圖4；結(jié)果經(jīng)多次重復(fù)測(cè)定證實(shí))。
在307例對(duì)照組(包括臨床工作人員、健康獻(xiàn)血者和未診斷為Graves病的患者)中，只有2例(0.65%)對(duì)M22結(jié)合的抑制率大于10%。其中一例患者(三代TRAb抑制率11%)報(bào)告過度疲勞(無明確原因)，另一例患者(三代TRAb抑制率12%)有原發(fā)性甲狀旁腺功能減退和自身免疫性甲狀腺功能減退。目前尚不清楚這些低檢測(cè)值(在反復(fù)試驗(yàn)中得到證實(shí))是試驗(yàn)中非特異性干擾的結(jié)果，還是與低水平TRAb有關(guān)。但在二代TRAb和放免法中，兩例患者的血清均為TRAb陰性，但兩例患者的血清均含有TPO自身抗體(按先后順序分別為20 U/mL和70 U/mL)。
在特異性方面，三代TRAb不受TPO自身抗體或Tg自身抗體的影響，在18例自身免疫性甲狀腺功能減退患者中的17例未觀察到抑制現(xiàn)象，17例患者中一些患者一種或兩種自身抗體水平較高(9/17例TPOAb水平大于500 U/mL，4/17例TgAb水平大于1000 U/mL)。同樣，乙酰膽堿受體、dsDNA和類風(fēng)濕因子的自身抗體均不抑制M22的結(jié)合(圖3)，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了該試驗(yàn)的特異性。此外，高濃度的TSH(最高達(dá)3 U/L)、FSH(最高達(dá)69 U/mL)、LH(最高達(dá)10 U/mL)或hCG(最高達(dá)160 U/mL)對(duì)檢測(cè)沒有任何干擾。
圖5所示的ROC圖顯示，在108例Graves病組中，有5例(4.6%)TRAb檢測(cè)為陰性。在這5例患者中，患者A因甲狀腺相關(guān)眼病接受甲狀腺素(T4) (有131I治療史)和糖皮質(zhì)激素治療；患者B予卡比馬唑+T4治療5年；患者C卡比馬唑停藥9年，采血前甲狀腺功能正常；D患者接受T4治療(1976年用131I治療)?；颊逧在進(jìn)行TRAb檢測(cè)時(shí)沒有臨床資料。二代TRAb測(cè)定A-E患者血清中TRAb均為陰性(均小于1 U/L，抑制率小于10%)，放免法結(jié)果呈陰性或在灰區(qū)(TSH結(jié)合的抑制率為6% - 15%)。此外，5份血清中均未檢測(cè)到Tg自身抗體，1份血清中TPO自身抗體水平較低(2.5 U/mL)。我們無法在這5份血清中檢測(cè)到TRAb，這可能與5例患者中至少4例在臨床和生化特征，以及對(duì)TSHR缺乏主動(dòng)免疫反應(yīng)的原因有關(guān)。
二代TRAb能檢測(cè)到96/108(89%)的Graves病血清，特異性為100%。二代ELISA結(jié)果陽性的樣本，在三代ELISA中均能檢測(cè)到。ROC曲線同時(shí)強(qiáng)調(diào)，相比于放免法，固相包被TSHR的ELISA方法更有*性。在放免法中，100%的特異性情況下，108份Graves血清中只有67份(62%)被檢測(cè)到TRAb，其靈敏度明顯低于本文介紹的新TRAb測(cè)定方法。
基于標(biāo)記的TSHR單克隆抗體檢測(cè)TSHR自身抗體的方法已有報(bào)道[5,6]。然而，基于純化Graves患者IgG檢測(cè)TSHR自身抗體的方法早在幾十年前就有報(bào)道[10,11]。然而，在TSHR自身抗體檢測(cè)中，與親和純化的患者血清自身抗體作為配體相比，人或動(dòng)物TSHR單克隆抗體確實(shí)具有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)，例如這類單抗容易生產(chǎn)為大批量、質(zhì)地均勻、純凈且穩(wěn)定的制劑。單克隆抗體也相對(duì)容易操作(例如，通過片段化或突變)，以獲得適合特定測(cè)定系統(tǒng)的制劑。
三代TRAb與二代TRAb間檢測(cè)Graves病血清TRAb結(jié)果密切相關(guān)(r=0.99)。此外，來自FIRS 實(shí)驗(yàn)室的Sanders等人也觀察到一系列Graves病患者血清在抑制小鼠促甲狀腺激素受體單克隆抗體對(duì)TSHR的結(jié)合抑制，以及患者血清對(duì)標(biāo)記TSH和TSHR之間的結(jié)合抑制間的密切關(guān)系[5]。此外，無論自身抗體是常見的刺激型還是少見的阻斷型，對(duì)受體的結(jié)合效果似乎效果接近[5,6,13]。這些早期的研究和目前的報(bào)道都強(qiáng)調(diào)了患者血清中TSHR自身抗體(無論刺激型或阻斷型)、TSH和促甲狀腺單克隆抗體(包括M22™)在TSHR上的結(jié)合位點(diǎn)之間的密切關(guān)系。然而，研究結(jié)果與有關(guān)TSHR不同區(qū)域參與TSHR自身抗體與TSH激動(dòng)劑和TSH拮抗劑特性結(jié)合的報(bào)道不一致[14-16]。
總之，我們所描述的基于M22-生物素的TRAb的最新第三代檢測(cè)方法比起早期檢測(cè)方法有相當(dāng)大的優(yōu)勢(shì)，在檢測(cè)低水平自身抗體方面是非?？煽康?。尤其需要評(píng)估低水平TSHR自身抗體檢測(cè)，三代TRAb在早期輕度Graves病患者和有Graves病眼部體征但無甲亢史的患者中具有應(yīng)用價(jià)值。
參考文獻(xiàn) Smith B R , Bolton J , Young S , et al. A New Assay for Thyrotropin Receptor Autoantibodies[J]. Thyroid, 2004, 14(10):830-835.
在線咨詢